一般財団法人環境イノベーション情報機構
一般細菌及び大腸菌分析について
登録日： 2006年05月03日 最終回答日：2006年05月15日 水･土壌環境 水質汚濁
No.16359 2006-05-03 10:03:30 匿名1212
環境分析の初心者です。
一般細菌、大腸菌についてお聞きしたいことがあります。
水道水（飲料水）を一般細菌を分析した際、ブランクに細菌反応がでる場合があり、困っています。
ブランク水は次のようにして作成しています。
純粋＋塩化ナトリウム→滅菌（121度15分）
上記ブランク水を十分に冷ましてから、使用しています。
アドバイスをお願いします。
総件数 3 件 page 1/1
No.16478 【A-3】
Re:一般細菌及び大腸菌分析について
2006-05-15 13:12:52 なんちゃって計量士 （
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結露そのものはクロス･コンタミの直接の原因にはなりませんが、確かに読み取りにくくなります。しかし、通常はペトリ皿を上下逆さにして培養し、裏から読み取るので通常はそれほど問題にならないはずですが？
結露するのは大きく二つの要因が考えられます。
一つは培養基（寒天）の水分が多すぎる場合です。通常試薬制作者の指示の通りにすればペトリ皿に投入して数十秒で固化して長時間放置冷却する必要はないはずです。投入前の温度が高すぎませんか？
二つめは室内およびペトリ皿の温度が高く、空気中の水蒸気による結露です。室内温度が高くありませんか？
あと、室内環境が良く３の操作時にブンゼンバーナー等を３、４本赤色燃焼させ、上昇気流を作るをおこなえば数分おいたまま乾燥しても殆ど落下はしませんが不確定で不安定な操作ですのであまり好ましくはないと思います。（野戦病院などで室内環境がどうしても確保できない場合の非常手段と考えてください）
どうしても乾燥したいのならば、清浄な治具を使用して蓋を半開放にして乾燥すればよいのですが、この場合使用する治具が汚染されていれば意味がありません。滅菌したガラス棒などの一回使用などの方法があります。
純水（誤字には気をつけてください）装置のタンクですが、できれば毎日作業終了時にタンクに残っている分は洗浄瓶にすべて取ってしまい、前日の分は一次洗浄に使用するなど、他の化学分析でもなるべく古い純水はどうでも良い部分に使用するようにした方が分析が安定します。特に洗浄瓶に残っている分は来歴が定かでないので当日に採取した分を利用する分は他の洗浄瓶と確実に分けた方がよいです。
回答に対するお礼･補足
なんちゃって計量士さま
度々のご回答本当にありがとうございますm(__)m
ご指摘通り、寒天添加後に半開き冷却操作を行った場合と、蓋を閉めて冷却の場合を比べた結果、思ったよりも読み取りにくいということもありませんでした。冷却時間の短縮にもつながり、ブランクに菌は出ておりません。、良い方向に進んでおります。
単になんちゃって計量士さまのご意見があったお陰です。
以前は、滅菌作業をするから…と前日作成の純水を使用しておりましたが、徹底して当日作成の純水を使用することにいたしました。
No.16375 【A-2】
Re:一般細菌及び大腸菌分析について
2006-05-06 09:58:53 なんちゃって計量士 （
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ここは結構つっこみ所が満載です。
ピペット・ペトリ皿滅菌方法は確実ですか？（オートクレーブの内部温度実測されていますか？表示温度計の誤差は？）
滅菌方法は？（ケース等に入れている、バラ）
滅菌後使用するときの取り出し方法？（コンタミ、汚染物との接触）
使用するまでの置き方？（置いてある場所は清浄？落下菌？周囲からの付着？滅菌からの経過時間？）
操作者からの汚染？（ピペットの操作方法は）等
>2.滅菌機で溶かし、約50℃前後まで冷ました（室内で自然冷却）寒天を約15mℓをペトリ皿へ混合させるように投入
>
操作者からの汚染？（投入の操作方法は）
冷却中の汚染？（口廻り）
操作上の汚染？（投入時にペトリ皿や周囲に触れたりしていませんか）
>3.10倍希釈したサンプルを同じように投入
>
１と同様。
希釈水の調整時の汚染は？
>4.寒天が冷え切るまで、ふたを少し開けて自然放置
>
ここでの汚染が一番多いです。
室内の汚染状況は、落下菌対策は？横からの気流はありませんか？（空調機からの吹き出しなど）
>5.寒天が冷えた後、ペトリ皿をテープで密閉させる
>
よけいなことですが、テープは殆ど意味がないと私はおもいますが？
>6.36℃±培養機→24時間
>
ここは殆ど関係ないと思います。
後考えられるのが純水製造装置のタンクが高温耐性菌に汚染されている。
等かと考えられます。
ブランクででた細菌を同定すればもう少し具体的に絞れると思いますが、一番多いと考えられる落下菌の対策を記載しておきます。
１．室内環境を良くする。
２．操作時に空調機、換気扇などを止める。
３．操作時にブンゼンバーナー等を３、４本赤色燃焼させ、上昇気流を作る。
４．4の冷却操作を蓋を閉めておこなう。又はその上から寒天を追加してサンドイッチにして蓋をしてしまう。
以上ご参考になれば
落下菌の確認は、培養平板寒天を一定時間放置して、その後通常培養すれば確認できます。
回答に対するお礼･補足
なんちゃって計量士さま
ご回答ありがとうございます。
普段の作業手順にこれだけのご指摘を頂戴しまして、立場を忘れて感嘆しております。
ご指摘がありました純粋装置の汚染ですが、連休明けをきっかけとし、洗浄、カートリッジの同時交換をしました。
あと、ご指摘がありました、落下菌の対策の4ですが、「冷却操作を蓋をしめて行う」とございますが、冷却操作を蓋をしめて行うと、ペトリ皿内に結露みたいなものができてしまい、分析の際に読み取りにくい、結露が菌の混入の原因になってしまわないか？という疑問が出ました。
アドバイスがございましたら、お願いしますm(__)m
No.16363 【A-1】
Re:一般細菌及び大腸菌分析について
2006-05-04 02:33:26 なんちゃって計量士 （
>ブランク水は次のようにして作成しています。
>純水＋塩化ナトリウム→滅菌（121度15分）
>（一部回答者修正）
質問者の操作手技の程度がわからないので、きちんとしたお答えはしにくいのですが、まず、操作手技中のクロス・コンタミと考えて間違いないと思います。
操作方法を詳しく書いていただけますか？あまりにも注意点が多すぎて1000字で説明しきれません。
一番多いのは環境中の細菌の落下、次に操作用具の汚染、開閉操作時の汚染等かと考えられます。
回答に対するお礼･補足
なんちゃって計量士 さま
回答頂いてありがとうございましたm(__)m
手法ですが、下記のとおりです。（標準寒天培地使用）
1.サンプルを1mℓメスピペット（滅菌済み）でペトリ 皿（使い捨て、滅菌済み）に投入。
2.滅菌機で溶かし、約50℃前後まで冷ました（室内で自然冷却）寒天を約15mℓをペトリ皿へ混合させるように投入
3.10倍希釈したサンプルを同じように投入
4.寒天が冷え切るまで、ふたを少し開けて自然放置
5.寒天が冷えた後、ペトリ皿をテープで密閉させる
6.36℃±培養機→24時間
アドバイス等がありましたら、よろしくお願いします。
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